qPCR樣所有PCR方法 - 擴增核酸，但qPCR也實時監(jiān)測過程。當qPCR工作時，科學家必須設計和驗證測定。這在該過程的各個方面造成各種挑戰(zhàn)。
“Promega（麥迪遜，威斯康星）研究和開發(fā)小組的**研究科學家Rod Pennington說：”在設計一個qPCR測定中心對選擇引物和探針序列以及報道染料，尤其是多重測定中的關鍵挑戰(zhàn)。“此外，寡核苷酸序列的選擇和與可用的實時qPCR儀器兼容的檢測化學物質可能是一種困難的平衡作用。”他補充說，“多重測定中希望檢測的目標越多，平衡作用越不穩(wěn)定可。”
另外的挑戰(zhàn)進一步使設計階段復雜化。例如，Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）遺傳分析的**產品經理Karen Li指出需要獲得**新的序列信息，避免“序列變異，包括SNP，插入，缺失和低復雜性序列“。有了這些信息，Li說，科學家然后需要確保”測定靶向獨特的序列，并且不會靶向基因組中的多個斑點。
靶標的特征影響PCR的工作程度。“在查看轉錄本時，**好在外顯子 - 外顯子連接處設計分析，以便不會檢測目標基因組DNA。”Li解釋說。“考慮是否需要檢測一個特定的轉錄本，或者如果你想檢測同一個基因的轉錄本變異。”她補充說，“對于轉基因實驗，確保你正在查看物種特異性靶點。
qPCR技術的一些進展使得更容易設計新的測定法。“具有多個檢測通道的qPCR儀器可以在一定程度上簡化測定設計，通過擴展設計寡核苷酸和探針的選項，”Pennington說。“在試劑方面，新的探針化學物質繼續(xù)被引入，并增加了測定設計的靈活性。
科學家也可以依靠現有的qPCR測定。如Li所說，“我們有廣泛和不斷增長的預先設計的TaqMan分析的選擇，其跨越一系列應用 - 基因表達，SNP檢測，拷貝數分析等，其使用廣泛的生物信息學分析設計，使用**新的序列信息來自公共數據庫，并對測定設計進行計算機質量控制以應對這些挑戰(zhàn)。
對于新的qPCR測定，請考慮使用設計工具。正如李先生指出的，“有許多測定設計工具可以幫助定制化驗設計。”她補充說，“我們的定制化驗設計工具--www.Thermofisher.com/ cadt-具有'定制加'管道選項將執(zhí)行在我們預設計的測定法上進行的相同的生物信息學分析“。例如，該工具通常設計具有較小擴增子的分析，以在PCR反應中獲得更好的效率，并且為轉基因實驗和轉錄物特異性靶標提供選擇。
一旦科學家設計了一種測定，還有更多的工作要做，如優(yōu)化它。“qPCR測定的成功取決于必須優(yōu)化大量變量，例如組分濃度和熱循環(huán)參數，”Pennington解釋說。“qPCR測定的優(yōu)化矩陣可能非常復雜，應包括代表性樣品材料的測試。
所需的優(yōu)化級別取決于設計的質量。“良好的測定設計對于**大限度減少優(yōu)化qPCR測定所需的工作**關重要，”Li說。“如果不注意在均勻的溫度下設計引物和探針，優(yōu)化可能會有挑戰(zhàn)性。”如果設計不夠仔細，則需要更多的工作來盡可能高效地運行測定。As Li解釋說，“如果您不進行優(yōu)化您的測定設計的前期工作，您將需要優(yōu)化您的PCR反應，以找到**佳的退火/延伸溫度，不僅適用于您的引物和探針，你的主人混合和儀器。
在某些情況下，優(yōu)化可能比在其他情況下更難。Pennington說：“如果樣品材料難以獲得，測定優(yōu)化實驗材料的可用性可能會有問題。
為了在優(yōu)化的**佳結果，科學家可能尋求qPCR技術的具體功能。“具有高通量潛力的儀器可以幫助優(yōu)化，”Pennington說。“高通量潛力可能來自快速熱循環(huán)，容易與機器人移液站接口或其他功能。”同時運行多個熱循環(huán)曲線也可加快科學家優(yōu)化測定的速度。
試劑也影響優(yōu)化。“新的主混合產品相當頻繁地引入，并且在某些情況下允許從優(yōu)化矩陣中去除某些參數，例如MgCl 2或酶濃度，”Pennington解釋說。“這可以減少實驗所需的實驗范圍。
在經過設計和優(yōu)化qPCR測定的步驟后，需要對其進行驗證，以證明它真正做到了應該做的事情。BioNTech Diagnostics（德GMainz）分子診斷科學家Mark Laible說：“從我的角度來看，qPCR測定驗證中**具挑戰(zhàn)性的部分是由不同qPCR平臺引入的方差評估。“注意到您開發(fā)的測定儀器類型容易出現大的儀器間變化，這可能非常令人失望。
為了減少這種問題的可能性，他說，**好是“在技術開發(fā)早期選擇儀器間差異較小的儀器”。Laible說，要做這樣的選擇，應該**少“三種不同儀器的特定型號“。他補充說，”大多數儀器制造商都有助于讓您與其他實驗室接觸。
驗證所需的努力通常取決于手頭的應用。在許多情況下，市售的測定法將完成這項工作。然而，當需要時，可以開發(fā)用于特定應用的全新的qPCR測定。通過合適的qPCR和試劑，加上經驗和設計工具，科學家可以設計，優(yōu)化和驗證測定。
